馬紅球菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒使用方法:

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

按照試劑盒操作說明或者微生物樣品處理方法做好樣品前處理。

1.2 DNA 提取

根據(jù)您實驗室的具體情況和樣品類型，選擇適當(dāng)?shù)奶崛〔呗苑椒?。為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，樣本核酸提取過程中應(yīng)避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測，建議-15℃以下保存。

推薦采用我們公司研發(fā)生產(chǎn)的試劑盒：Hypure 病毒基因組 DNA 提取試劑盒

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

2.1 從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強光照射，待完全溶解后振蕩混勻并低速離心 10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費。

2.2 根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑

鮭腎桿菌反應(yīng)液

鮭腎桿菌擴增液

用量（樣本數(shù)為N）

19.5μL

0.5μL

2.3 在適當(dāng)容積的無菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后 2000 rpm 離心 10 s，按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián) PCR 反應(yīng)管中。

2.4 蓋緊八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋, 并注意做好相應(yīng)標(biāo)識（請標(biāo)記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋兩端突出部位，切勿標(biāo)記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋中間，以免影響信號采集）。將 PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1.2 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過程中應(yīng)避免污染。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi), 并記錄放置順序。

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25 μL；

熒光通道選擇：檢測通道選擇 FAM， 淬滅通道選擇 NONE，參比熒光選 NONE。

4.4 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

3min

否

2

40 cycle

95℃

15sec

否

55℃

30sec

否

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤38.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：檢測結(jié)果 Ct 值無 Ct 值，無明顯的擴增曲線。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤30；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。

最低檢測限：1.0×103copies/mL。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。

8. 檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。